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Jan 30, 2024

Neu identifizierter Entsorgungsmechanismus für proteasomales Protein umgeht Ubiquitin-Tagging

Proteasom arbeitet mit Ubiquitin zusammen, um Proteine ​​abzubauen. [Love Employee/Getty Images] Forscher der Harvard Medical School (HMS) haben herausgefunden, dass ein Protein namens Midnolin eine Schlüsselrolle dabei spielt

Proteasom arbeitet mit Ubiquitin zusammen, um Proteine ​​abzubauen. [Liebe Mitarbeiter/Getty Images]

Forscher der Harvard Medical School (HMS) haben herausgefunden, dass ein Protein namens Midnolin eine Schlüsselrolle beim Abbau vieler kurzlebiger Kernproteine ​​spielt. Ihre Studie zeigte, dass Midnolin diese Proteine ​​direkt angreift und in das zelluläre Abfallentsorgungssystem, das sogenannte Proteasom, zieht, wo sie zerstört werden. Und während Zellen typischerweise Proteine, die zur proteasomalen Zerstörung bestimmt sind, mit dem kleinen Molekül Ubiquitin markieren, ergab die neu veröffentlichte Studie, dass der Midnolin-Proteasom-Mechanismus dieses kanonische Ubiquitinierungssystem umgeht.

Da die Proteine, die durch den neu identifizierten Prozess abgebaut werden, Gene mit wichtigen Funktionen im Zusammenhang mit dem Gehirn, dem Immunsystem und der Entwicklung modulieren, können Wissenschaftler den Prozess möglicherweise als eine Möglichkeit zur Steuerung des Proteinspiegels nutzen, um diese Funktionen zu verändern und zu korrigieren Funktionsstörung. „Diese besonderen kurzlebigen Proteine ​​sind seit über 40 Jahren bekannt, aber niemand hatte herausgefunden, wie sie tatsächlich abgebaut werden“, sagte Xin Gu, PhD, wissenschaftlicher Mitarbeiter für Neurobiologie an der HMS. „Der Mechanismus, den wir gefunden haben, ist sehr einfach und ziemlich elegant“, kommentierte Christopher Nardone, Doktorand in Genetik an der HMS. „Es ist eine grundlegende wissenschaftliche Entdeckung, aber es gibt viele Auswirkungen auf die Zukunft.“

Die Co-Hauptautoren Gu, Nardone und Kollegen berichteten über ihre Ergebnisse in Science in einem Artikel mit dem Titel „Der Midnolin-Proteasom-Weg fängt Proteine ​​für den ubiquitinierungsunabhängigen Abbau“, in dem sie zu dem Schluss kamen: „Unsere Studie legt nahe, dass der Midnolin-Proteasom-Weg Proteine ​​für den Ubiquitinierungs-unabhängigen Abbau fängt.“ Der Proteasom-Weg könnte einen allgemeinen Mechanismus darstellen, durch den das Proteasom das kanonische Ubiquitinierungssystem umgeht, um einen selektiven Abbau von Kernproteinen zu erreichen, von denen viele für die Transkription entscheidend sind.“

Kurzlebige Proteine ​​steuern die Genexpression in Zellen, um eine Reihe lebenswichtiger Aufgaben zu erfüllen, von der Unterstützung des Gehirns beim Aufbau von Verbindungen bis hin zur Unterstützung des Körpers beim Aufbau einer Immunabwehr. Diese Proteine ​​werden im Zellkern hergestellt und nach getaner Arbeit schnell zerstört. Doch trotz der Bedeutung dieser Proteine ​​ist der Prozess, durch den sie abgebaut und aus den Zellen entfernt werden, sobald sie nicht mehr benötigt werden, den Wissenschaftlern jahrzehntelang verborgen geblieben.

Es ist allgemein bekannt, dass Zellen Proteine ​​abbauen können, indem sie sie mit Ubiquitin markieren. Die Markierung teilt dem Proteasom mit, dass die Proteine ​​nicht mehr benötigt werden, und es zerstört sie. Manchmal baut das Proteasom jedoch Proteine ​​ohne die Hilfe von Ubiquitin-Tags ab, was auf die Existenz eines anderen, Ubiquitin-unabhängigen Mechanismus des Proteinabbaus hinweist. „In der Literatur gibt es vereinzelte Hinweise darauf, dass das Proteasom unmarkierte Proteine ​​irgendwie direkt abbauen kann, aber niemand hat verstanden, wie das passieren kann“, sagte Nardone.

Eine Gruppe von Proteinen, die offenbar durch einen alternativen Mechanismus abgebaut werden, sind stimuliinduzierte Transkriptionsfaktoren. Diese Proteine ​​werden als Reaktion auf zelluläre Reize hergestellt und wandern in den Zellkern, um dort Gene zu aktivieren. Anschließend werden sie schnell zerstört. „Bei Säugetieren wird die Transkriptionsreaktion auf Wachstumsfaktoren, neuronale und Immunstimuli durch eine Gruppe von Genen vermittelt, die als Immediate-Early-Gene (IEGs) bezeichnet werden“, stellten die Autoren fest. „Die IEG-mRNAs reichern sich innerhalb von Minuten nach dem ersten Reiz an und sobald sie translatiert sind, werden ihre Proteine ​​schnell abgebaut, um einen vorübergehenden Ausbruch der Proteinexpression zu ermöglichen.“ Gu fügte hinzu: „Was mir am Anfang auffiel, war, dass diese Proteine ​​extrem instabil sind und eine sehr kurze Halbwertszeit haben – sobald sie hergestellt sind, erfüllen sie ihre Funktion und werden danach schnell abgebaut.“

Diese Transkriptionsfaktoren unterstützen eine Reihe wichtiger biologischer Prozesse im Körper, doch selbst nach jahrzehntelanger Forschung war „der Mechanismus ihres Umsatzes weitgehend unbekannt“, bemerkte Michael Greenberg, Nathan Marsh Pusey Professor für Neurobiologie am Blavatnik Institute der HMS Co-Senior-Autor des Artikels zusammen mit Stephen Elledge, dem Gregor-Mendel-Professor für Genetik und Medizin an der HMS und am Brigham and Women's Hospital. Die Autoren fuhren fort: „Obwohl die Mechanismen, die die IEG-Transkription regulieren, gut charakterisiert sind, blieb es viele Jahre lang ein Rätsel, wie IEG-Proteine ​​schnell zur Zerstörung angegriffen werden … es ist unklar, wie IEG-Proteine ​​abgebaut werden.“

Um den Mechanismus zu identifizieren, durch den diese Proteine ​​nach Abschluss ihrer Arbeit zerstört werden, konzentrierte sich das Team auf zwei bekannte Transkriptionsfaktoren: Fos, der vom Greenberg-Labor ausführlich auf seine Rolle beim Lernen und Gedächtnis untersucht wurde, und EGR1, der daran beteiligt ist Zellteilung und Überleben. „Wir stellten die Hypothese auf, dass es einen zellulären Weg gibt, der der schnellen Zerstörung von c-Fos und anderen IEG-Proteinen dient“, schrieben sie.

Das Team führte genomweite CRISPR-Cas9-Screenings durch, um nach Genen zu suchen, die die Stabilität der IEG-Proteine ​​in menschlichen Zelllinien regulieren, die zur Expression eines Reporters entwickelt wurden. Der größte Treffer bei den Untersuchungen war das MIDN-Gen, das bei Säugetieren für das weitgehend uncharakterisierte Midnolin-Protein kodiert. Das Team validierte seine Screening-Ergebnisse, indem es bestätigte, dass das Ausschalten von MIDN in menschlichen Zelllinien die Stabilität von EGR1 und FosB erhöhte. Interessanterweise stellten sie fest, dass eine Überexpression von Midnolin die Spiegel von cFos, FosB und EGR verringerte.

Die Folgeexperimente ergaben, dass Midnolin neben Fos und EGR1 möglicherweise auch am Abbau Hunderter anderer Transkriptionsfaktoren im Zellkern beteiligt ist. „Durch ein genetisches Gain-of-Function-Screening identifizierten wir eine große Gruppe potenzieller Ziele von Midnolin, das stark mit Kernproteinen, insbesondere Transkriptionsregulatoren, angereichert ist. Dabei zeigte sich, dass Midnolin im Großen und Ganzen die Funktion hat, den Abbau von Proteinen im Zellkern zu fördern, wo sich Midnolin selbst befindet überwiegend lokalisiert“, stellten die Ermittler fest.

Gu und Nardone erinnern sich, dass sie angesichts ihrer Ergebnisse schockiert und skeptisch waren. Um ihre Ergebnisse zu bestätigen, beschlossen sie, genau herauszufinden, wie Midnolin so viele verschiedene Proteine ​​angreift und abbaut. „Nachdem wir alle diese Proteine ​​identifiziert hatten, gab es viele rätselhafte Fragen darüber, wie der Midnolin-Mechanismus tatsächlich funktioniert“, sagte Nardone.

Mit Hilfe eines maschinellen Lerntools namens AlphaFold, das Proteinstrukturen vorhersagt, in Kombination mit Daten aus einer Reihe von Laborexperimenten konnte das Team die Details des Mechanismus konkretisieren. „Um Einblicke in die Interaktion von Midnolin mit dem Proteasom und seinen zahlreichen Substraten zu erhalten, haben wir mit AlphaFold eine vorhergesagte Struktur von Midnolin erhalten, die drei zuverlässig vorhergesagte und hochkonservierte Regionen mit definierter Struktur ergab“, schrieben sie. Die Forscher nannten eine dieser Regionen in Midnolin die „Catch-Domäne“, da sie den Teil des Midnolin-Proteins darstellt, der andere Proteine ​​effektiv aufnimmt und sie direkt in das Proteasom einspeist, wo sie abgebaut werden. Das Team fand heraus, dass die Catch-Domäne aus zwei separaten Regionen besteht, die durch Aminosäuren verbunden sind. Und interessanterweise stellten sie fest: „Durch die Löschung der Regionen, die sich zusammenfalten, um die Catch-Domäne zu bilden (die N-terminalen Catch1- und C-terminalen Catch2-Subdomänen), wurde die Wechselwirkung von Midnolin mit seinen Substraten aufgehoben, ohne seine Fähigkeit, das Proteasom zu binden, zu beeinträchtigen.“ Die Catch-Domäne erfasst effektiv eine relativ unstrukturierte Region eines Proteins, sodass Midnolin viele verschiedene Arten von Proteinen einfangen kann.

Bemerkenswert sind Proteine ​​wie Fos, die für die Aktivierung von Genen verantwortlich sind, die Neuronen im Gehirn dazu veranlassen, sich als Reaktion auf Reize zu verdrahten und neu zu verdrahten. Andere Proteine ​​wie IRF4 aktivieren Gene, die das Immunsystem unterstützen, indem sie dafür sorgen, dass Zellen funktionsfähige B- und T-Zellen bilden können. Die Autoren fassten ihre Ergebnisse zusammen und stellten fest: „Unsere Ergebnisse legen nahe, dass der Midnolin-Proteasom-Weg einen allgemeinen Mechanismus darstellen könnte, durch den das Proteasom das traditionelle Ubiquitinierungssystem umgeht, um einen selektiven Abbau vieler Kernproteine ​​zu erreichen.“ Elledge fügte hinzu: „Der aufregendste Aspekt dieser Studie ist, dass wir jetzt einen neuen allgemeinen, von der Ubiquitinierung unabhängigen Mechanismus verstehen, der Proteine ​​abbaut.“

Kurzfristig wollen die Forscher tiefer in den neu entdeckten Midnolin-Mechanismus eintauchen. Sie planen Strukturstudien, um die feineren Details besser zu verstehen, wie Midnolin Proteine ​​einfängt und abbaut. Sie erschaffen auch manipulierte Mäuse, denen Midnolin fehlt, um neue Einblicke in die Rolle des Proteins in verschiedenen Zellen und Entwicklungsstadien zu gewinnen.

Sie räumten jedoch auch ein, dass der Mechanismus, durch den Midnolin die Zerstörung seiner gebundenen Proteine ​​einleitet, noch nicht vollständig geklärt ist. „Wie Midnolin den Abbau gebundener Substrate initiiert, ist mechanistisch noch nicht vollständig geklärt. Wir wissen nicht, ob Midnolin mit seinen Zielen interagiert, bevor es an das Proteasom bindet, oder ob es konstitutiv mit dem Proteasom assoziiert und dann seine Substrate rekrutiert und so eine neue Unterklasse von Proteasomen im Zellkern definiert.“

Die Wissenschaftler gehen davon aus, dass der Befund ein verlockendes Übersetzungspotenzial hat. Es könnte einen Weg bieten, der genutzt werden könnte, um die Konzentration von Transkriptionsfaktoren zu steuern und so die Genexpression und damit die damit verbundenen Prozesse im Körper zu modulieren. „Der Proteinabbau ist ein kritischer Prozess und seine Deregulierung liegt vielen Störungen und Krankheiten zugrunde“, darunter bestimmte neurologische und psychiatrische Erkrankungen sowie einige Krebsarten, sagte Greenberg.

Wenn Zellen beispielsweise zu viele oder zu wenige Transkriptionsfaktoren wie Fos haben, kann es zu Lern- und Gedächtnisproblemen kommen. Die Autoren schlugen weiter vor: „Angesichts der Tatsache, dass viele IEG-Proteine ​​effizient auf den Abbau durch Midnolin abzielen und die präzise Expression von IEGs für Lernen und Gedächtnis von entscheidender Bedeutung ist, ist es möglich, dass eine Störung oder Verstärkung der Midnolin-Funktion die Fähigkeit von Tieren zum effizienten Abbau beeinträchtigen könnte.“ lernen und Informationen im Gehirn speichern.“ Und beim multiplen Myelom werden Krebszellen vom Immunprotein IRF4 abhängig, sodass dessen Anwesenheit die Krankheit befeuern kann. „… unsere Entdeckung, dass IRF4 stark auf den Abbau durch Midnolin abzielt, könnte Einblicke in die Funktion von Midnolin im Immunsystem liefern“, fügten sie hinzu.

Die Forscher sind besonders daran interessiert, Krankheiten zu identifizieren, die gute Kandidaten für die Entwicklung von Therapien sein könnten, die über den Midnolin-Proteasom-Weg wirken. „Einer der Bereiche, die wir aktiv erforschen, besteht darin, die Spezifität des Mechanismus so anzupassen, dass er gezielt Proteine ​​von Interesse abbauen kann“, sagte Gu.